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胰腺作为人体重要的消化与内分泌器官，在疾病研究和再生医学中占据核心地位。然而，由于人类胰腺组织的复杂性和实验材料的有限性，针对胰腺干细胞的研究长期以来受到限制。近年来，类器官技术的发展为研究胰腺干细胞提供了全新的工具，能够在体外环境中模拟器官的复杂结构和功能。荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers教授团队基于最新研究，探讨了人类胚胎胰腺干细胞（hfPO）的长期培养方法及其在三种胰腺细胞谱系分化中的潜力，包括外分泌腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞，为再生医学和疾病治疗提供了科学依据。
一、研究背景
胰腺的结构与功能：胰腺主要由三种细胞类型构成：外分泌腺泡细胞负责分泌消化酶，导管细胞负责输送酶至肠道，而内分泌细胞（主要集中于胰岛）分泌激素以调节血糖水平。在胚胎发育过程中，这些细胞谱系均来源于多能前体细胞。然而，体外模拟这些复杂分化过程一直是研究中的难题。
胚胎干细胞与类器官技术：胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的分化技术已被广泛应用于研究胰腺发育。然而，这些技术往往受到分化效率低、细胞谱系有限等问题的限制。类器官技术通过利用组织来源的干细胞或胚胎组织，能够在三维环境中培养出具有器官特征的结构，从而提供更为真实的研究模型。
研究目的：研究旨在建立一种基于人类胚胎胰腺组织的体外培养模型，以长期维持干细胞活性并支持多谱系分化。研究重点包括：识别标志性干细胞（如LGR5+细胞），验证其在多谱系分化中的潜力，并探讨胰腺类器官在胰岛素分泌和消化酶产生中的功能。
二、研究设计与方法
组织来源与培养条件：研究从8至17周龄的胚胎胰腺组织中分离干细胞，通过类基膜提取物（BME）培养基进行三维培养。为了优化培养条件，实验测试了40种不同的培养基组合，最终确定了一种能够支持长期培养的胰腺类器官（hfPO）培养基。
分化与功能验证：通过调整培养基成分（如去生长因子培养基和特定分化诱导剂），研究实现了hfPO向外分泌腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞的分化。分化后的细胞通过单细胞RNA测序、免疫荧光、透射电子显微镜等多种方法进行表型和功能分析。
LGR5+细胞的标记与追踪：LGR5被认为是三谱系干细胞的标志物。研究通过CRISPR/Cas9技术为LGR5基因添加荧光标记，以追踪其在干细胞分化中的动态变化。同时，通过克隆培养和单细胞分化实验验证了LGR5+细胞的多能性。
三、研究结果
hfPO的长期培养与稳定性：实验成功建立了18条hfPO细胞系，其中部分细胞系在优化培养基中能够稳定扩增超过两年。培养中，hfPO展现出类似胚胎胰腺组织的三维结构，且在长期培养过程中保持了基因组的稳定性。
外分泌腺泡细胞的分化：通过特定分化培养基的诱导，hfPO成功分化为表达腺泡细胞标志物（如CPA1和PTF1A）的细胞。这些细胞不仅产生消化酶（如胰蛋白酶和脂肪酶），还在电子显微镜下显示出典型的酶颗粒结构，表明其功能与成熟腺泡细胞相似。
内分泌细胞的生成：在内分泌分化培养基中，hfPO分化为表达CHGA、INS、GCG等胰岛激素的细胞。这些细胞中既包含多激素表达的未成熟细胞，也包括单一激素表达的成熟细胞。进一步分析显示，hfPO能够分泌胰岛素等功能性激素，其分泌水平与胚胎胰岛组织相近。
LGR5+细胞的多谱系分化潜力：LGR5+细胞在体外展现出显著的自我更新能力及三谱系分化潜力。单细胞克隆实验显示，LGR5+细胞能够生成所有三种胰腺细胞谱系，并在连续传代中保持干细胞特性。
四、讨论与意义
胰腺干细胞研究的突破：研究首次从人类胚胎胰腺组织中分离出具有三谱系分化能力的干细胞，并通过类器官技术实现了长期培养。为揭示胰腺发育和疾病机制提供了全新的实验平台。
再生医学的潜力：hfPO在胰岛素分泌和消化酶产生中的功能表明，其在糖尿病和胰腺疾病治疗中具有重要应用前景。通过进一步优化分化条件，hfPO有望成为器官移植的替代方案。
LGR5+细胞的标志性意义：LGR5作为三谱系干细胞的关键标志，为胰腺干细胞的分离和应用提供了新思路。未来可通过基因编辑和细胞工程技术进一步探索LGR5+细胞的临床潜力。
4. 研究的局限性
尽管研究取得了显著进展，但仍存在一些局限性。例如，hfPO的分化效率和成熟度仍需优化；同时，由于组织样本来源限制，研究结果的普适性有待验证。
五、未来展望
进一步优化分化策略：通过高通量筛选和生物信息学分析，探索更多调控因子以提高hfPO的分化效率和成熟度。
个性化医学应用：结合患者特异性iPSCs和hfPO技术，为糖尿病和胰腺疾病患者提供定制化治疗方案。
跨学科协作：融合类器官技术、基因编辑和生物材料科学，开发新型胰腺替代品或疾病模型。
参考文献
Amanda Andersson-Rolf, Kelvin Groot, Jeroen Korving, et al. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages. [2024-12-02]. DOI:
10.1016/j.cell.2024.10.044
