基因先导编辑的研究近况与应用

2019年10月21日，刘如谦（David Liu）团队在 Nature 期刊发表论文，开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editor，PE），无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除。

1、2024年将进行首次基因先导编辑临床试验

2023年5月，刘如谦团队在 Nature Biotechnology 期刊发表论文，对先导编辑进行了改进和升级——双先导编辑（Twin Prime Editing，TwinPE），能够实现大片段DNA的删除、替换、整合和倒位，为治疗复杂人类遗传疾病或大型基因突变所致的人类遗传疾病提供了有效工具。

在今年8月发布的第二季度业绩中， Prime Medicine 传达了明年对其核心技术先导编辑进行首次人体临床试验的可能性，并公开列出了预期将要到来的里程碑：最早在2024年完成首次IND申报。此外，Prime Medicine 在上个月向投资者表示，预计在2025年将提交更多IND申报。

相比之下，刘如谦于2016年开发的碱基编辑（Base Editor）正在进行6项临床试验。

目前，Prime Medicine 官网上共列出了18个研发项目，目前进度最快的是治疗慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease，CGD）的疗法，处于IND申报阶段。这是一种X染色体连锁隐性遗传疾病，由于编码细胞色素b的qp91-phox亚单位基因突变引起，患者反复发生全身各部位的化脓性感染，严重者会发生败血症而危及生命。

今年5月，Prime Medicine的研究人员在美国基因和细胞治疗学会（ASGCT）第26届年会上提交了最新临床前数据，报告了先导编辑修复慢性肉芽肿病（CGD）致病突变的潜力。报告显示，对来自4名捐赠者的CD34+长期造血干细胞的先导编辑精确纠正了p47phox致病突变，编辑水平超过92%，并恢复了这些细胞后代的NADPH氧化酶活性和髓细胞功能。

在ASGCT会议上，Prime Medicine 重点介绍了其先导编辑辅助位点特异性整合酶基因编辑平台（PASSIGE™）平台，展示了其在不使用病毒载体的情况下产生多重编辑的CAR-T细胞疗法治疗某些癌症和免疫疾病的潜在应用。

2、基因先导编辑有望安全有效地治疗镰状细胞病

镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）是一种影响数百万人的严重血液疾病，主要是那些非洲裔。编码携带氧气的蛋白分子---血红蛋白---的一个亚基的基因突变导致这种疾病。

在一项新的研究中，来自美国圣犹大儿童研究医院和布罗德研究所的研究人员表明作为一种精确的基因组编辑方法，先导编辑（prime editing）可以将SCD患者细胞中突变的血红蛋白基因改回到它们的正常形式，在将这些经过基因编辑的细胞移植到小鼠体内后恢复它们的正常血液参数。相关研究结果于2023年4月17日在线发表在Nature Biomedical Engineering期刊上，论文标题为“Ex vivo prime editing of patient haematopoietic stem cells rescues sickle-cell disease phenotypes after engraftment in mice”。

2.1 修复导致镰状细胞疾病的突变

这些作者发现这种先导编辑系统能够以高特异性找到成体血红蛋白基因中的致病突变，并以大多数人类携带的健康DNA序列有效地取代它。先导编辑成功地校正了这种突变，在SCD患者的造血干细胞中的校正率高达41%。以前的研究已表明，对超过20%的细胞进行先导编辑可能会转化为治疗效果。

这些作者将来自四名SCD患者的经过先导编辑的造血干细胞移植到小鼠体内时，约45%的循环红细胞中存在正常的血红蛋白生成，甚至在17周后仍然如此，因此这种方法的治疗前景更加明显。移植后，当放置在低氧环境中时，从小鼠骨髓中分离出来的红细胞减少了一半的镰状病变，从大约67%减少到37%。

2.2 提高精确的基因编辑

论文共同作者、圣犹大儿童研究医院血液学系主任Mitchell Weiss博士说，“我们确定了可能是遗传性贫血的下一波疗法。我们采用了最新的前沿基因工程技术，并表明我们可能在未来的治疗方法中进行有意义的基因编辑。”

虽然这些作者在移植到小鼠的SCD患者细胞中进行了研究，但这种方法可能比目前临床试验中使用的在DNA中产生双链断裂的基因组编辑方法（比如Cas9核酸酶）更有优势，因为先导编辑基本上可以避免在DNA中产生双链断裂。2021年发表在Nature期刊上的一项研究已表明作为一种替代性的基因组编辑技术，碱基编辑可以将镰刀型细胞突变变成良性变体，但不能变成原始的健康序列。这项新的研究显示先导编辑可以通过T-A转换将致病突变变成原来的正常基因变体，而碱基编辑不能进行这种转换。

尽管这项新的研究显示了利用先导编辑来治疗遗传性贫血的潜在好处，但它也显示了局限性。先导编辑需要一个耗时的过程来改进和优化实验流程中的每一步，比如设计用于先导编辑的向导RNA（prime editing guide RNA, pegRNA），pegRNA可将这种先导编辑系统靶向正确的DNA区域并进行所需的编辑。

3、通过计算模型预测先导编辑效率及脱靶率，拓展其应用前景

先导编辑（PE）是一种能够实现任意碱基替换、DNA短片段插入和缺失、以及这些变化的组合的基因编辑技术，先导编辑器由PE向导RNA（pegRNA）、逆转录酶MMLV与nCas9组成。目前已经报道了多种PE系统，包括PE1、PE2、PE3、PE4、PE5。

要想实现高效率的先导编辑，pegRNA的合理设计是其中的关键。pegRNA包括一个引导序列、tracrRNA支架、一个逆转录模板（RTT）和一个引物结合位点（PBS），在结构上可以说是相当的复杂。为了进行一次有效的先导编辑，研究团队需要设计成百上千个pegRNA、进行大量的实验，才能筛选到寥寥几个可以满足要求的pegRNA。

研究团队通过高通量、无误差的方式使用五个不同的数据库评估了总共338996对pegRNA的PE效率。这种高通量评估使得研究人员能够广泛和系统地确定影响PE效率的因素。这些结果表明，PE效率会随着编辑核苷酸数量的增加而降低，特别是对于三个以上的核苷酸，其编辑效率会大大降低。此外，研究还发现，无论编辑类型和RTT长度如何，在高效PE编辑的最后一个模板化位置的首选核苷酸在C>T>A>G的顺序排列。

研究团队总结了与PE效率相关的20个最重要的特征，包括PBS序列的熔解温度（Tm值）、GC含量、DeepSpCas9评分以及同源互补序列长度等等，并揭示这些因素是互相影响的，即每个因素的最佳范围通常取决于其他因素的水平。

3.1 影响PE效率的相关特征

基于PE效率的大型数据集，研究团队开发了两个计算模型——DeepPrime和DeepPrime-FT，其设计的pegRNA使用优化的pegRNA支架、最佳协同编辑PAM序列和更高效的PE变体，不仅提高了PE系统的编辑效率，还可以准确预测7种不同细胞类型中所有可能的编辑类型组合的各种PE系统的效率。

3.2 开发用于预测PE编辑效率的计算模型

为了验证其实用性，研究团队测试了DeepPrime和DeepPrime-FT是否可以生成编辑效率更高的、用于纠正致病性突变的pegRNA：与合理设计的pegRNA相比，基于DeepPrime的pegRNA设计可以将平均编辑效率提高2.1倍，而对于DeepPrime-FT来说，这一数值为5.7倍。

3.3 计算模型预测的pegRNA具有更高的PE编辑效率

不仅如此，研究团队还广泛地分析了PE系统的脱靶率，并开发了一个计算模型——DeepPrime-OFF用于预测不匹配目标序列的PE效率，并证明DeepPrime-OFF有助于减少潜在的脱靶位点的数量，并确定应该测试的pegRNA的优先级。

3.4 DeepPrime-OFF用于预测不匹配目标序列的PE效率

总而言之，这项发表在 Cell 的研究大规模分析了先导编辑效率数据，由此广泛表征了先导编辑的决定因素，并开发了一系列的计算模型来预测在多种细胞类型中不同先导编辑系统的效率，以及脱靶率。通过这些计算模型，科学家们可以通过计算预测先导编辑和pegRNA的不同组合在匹配或不匹配的目标序列处的编辑效率，以选择最有效和最具体的组合。

参考资料：

[1]刘如谦：2024年将进行首次先导编辑临床试验[EB/OL].(2023.10.13).[2023.12.08].https://news.bioon.com/article/2bdfe9588303.html

[2]Nature子刊：先导编辑有望安全有效地治疗镰状细胞病[EB/OL].(2023.04.30).[2023.12.08].https://news.bioon.com/article/7a82e68775ab.html

[3]Cell重磅：通过计算模型预测先导编辑效率及脱靶率，拓展其应用前景[EB/OL].(2023.05.10).[2023.12.08].https://news.bioon.com/article/699fe7084770.html